大豆的开花时间和株型结构是对光周期极为敏感的，这限制了大豆优良品种的引种推广以及产量的提高。众所周知，光信号通过光敏色素A（E3/E4）调节一个生物钟夜间复合物（EC）关键组分J，以控制光周期性开花。然而，其分子机制仍不清楚。
近日，中国农业科学院作科所和广州大学的联合研究团队在《PNAS》在线发表了题为“GmEID1 modulates light signaling through the Evening Complex to control flowering time and yield in soybean”的研究论文，介绍了研究团队发现大豆GmEID1蛋白作为连接E3/E4感知的光信号和生物钟夜间复合物（EC）的桥梁，参与调控大豆开花抑制因子E1基因表达。此外，研究发现GmEID1可作为调节大豆开花时间的目标位点，在通过基因编辑和常规育种改良大豆的生态区适应性和产量方面有很大的潜力。1、GmEID1是开花期的调控因子（图1）。在长日照（LD）条件下，大豆编码光敏色素A识别蛋白的E3和E4基因会促进豆科植物特异的开花抑制子E1的表达，导致花期延迟。研究团队通过RNA-seq方法挖掘到一个与E1相反的节律性表达模式的基因GmEID1，与拟南芥中的EID1（AtEID1）基因同源（该基因编码一个F-box蛋白，参与PHYA介导的光信号传导途径）。与J基因类似，GmEID1基因在地上组织高度表达（包括叶片和嫩梢组织），其亚细胞信号定位于细胞核中，这表明GmEID1很有可能参与大豆中GmPHYA介导的光信号传导途径。为了验证这一猜想，研究团队构建了Tianlong1（TL1）遗传背景下的CRISPR/Cas9突变体Gmeid1-1和Gmeid1-2、Williams82（W82）遗传背景下的CRISPR/Cas9突变体Gmeid1-3和Gmeid1-4、Tianlong1（TL1）遗传背景下的35S::YFP-GmEID1过表达材料。表型分析结果显示，在LD和SD条件下GmEID1基因敲除或者过表达分别会引起明显的晚花或早花表型（图1 B-D）。这表明GmEID1基因调控大豆的开花与光周期无关。
图1 GmEID1是一个开花增强子基因
2、GmEID1抑制E1的转录（图2）。为了深入了解GmEID1是如何促进开花的，研究团队比较了在LD或SD条件下野生型TL1和Gmeid1突变体中关键开花基因的昼夜表达水平。qRT-PCR结果表明，与TL1相比，GmFT2a和GmFT5a的mRNA水平在Gmeid1突变体中要低得多（图2 A-D）。但与TL1相比，GmEID1过表达品系中的GmFT2a和GmFT5a的mRNA转录水平有所增加。同样的，E1 的mRNA转录水平在Gmeid1突变体中被显著上调（图2 E-F），在GmEID1过表达品系中则下调。有趣的是，E1上游的生物钟组份基因J、GmCCA1a和GmPRR3b并没有在昼夜条件下表现出明显的变化，Gmeid1突变体和GmEID1过表达品系中均是如此。上述结果表明，GmEID1基因通过抑制E1的表达来促进大豆开花。
图2 开花期相关基因在敲除突变体和对照材料中的时间性表达
3、GmEID1与J互作促进开花（图3）。鉴于GmEID1和J在抑制E1表达以及促进开花方面有相似的表现，再加上在Gmeid1突变体和GmEID1过表达品系中J的表达都没有明显的变化，研究团队推测GmEID1可能通过与J的相互作用而发挥作用。与这一假设相一致的是，β-半乳糖苷酶活性试验表明，GmEID1不仅与J/GmELF3a相互作用（图3A），而且还与其他两个ELF3同源蛋白GmELF3b-1和GmELF3b-2相互作用。此外，其他潜在的EC组份（包括GmELF4a和GmELF4b，但不包括GmLUX1和GmLUX2）也显示了与GmEID1的相互作用的信号（图3A）。GmEID1和GmELF3s之间的物理互作通过共免疫沉淀（Co-IP）实验和双荧光素酶实验得到了进一步的证实。这些结果表明，GmEID1可能通过与GmELF3s和GmELF4s相互作用来影响EC的活性，从而调控开花时间。4、GmEID1增强了J蛋白的表达丰度（图3）。考虑到GmEID1是一个F-box蛋白，很有可能作为一个E3连接酶通过泛素途径破坏目标蛋白的稳定性而发挥作用。为了测试GmEID1是否影响了J蛋白的稳定性，研究团队通过构建野生型W82和突变体Gmeid1-4突变体背景下的35S::J-3xFlag根系诱导胼胝体表达（RICE）系统，比较多个遗传转化体系中的J蛋白表达丰度。结果显示，W82遗传背景下的J-Flag蛋白表达水平高于Gmeid1-4突变体背景，表明GmEID1与J-Flag的表达丰度呈正相关。特别的是，在W82背景下J-Flag蛋白的丰度与它的转基因mRNA水平呈正相关，而Gmeid1-4突变体则不然。此外，Gmeid1-4突变体中的E1的的整体表达水平高于野生型。为了测试了GmEID1是以什么样的表达模式来影响J蛋白的丰度，研究团队选取了两个表达水平相似的有代表性的根系诱导胼胝体，野生型W82背景的J-Flag/W82 #2和Gmeid1突变体背景的J-Flag/Gmeid1 #3（图3 C-D）。免疫印迹结果表明，Gmeid1突变体中的J-Flag蛋白水平比野生型W82的低（图3 C、E）。为了测试GmEID1和J之间的遗传关系，研究团队将W82遗传背景的Gmeid1-3和Gmeid1-4的突变体与j突变体进行杂交。分子分析表明，Gmeid1-4很可能是一个由移码突变产生的功能缺失突变体，而Gmeid1-3可能是一个弱突变体，转录一个缺少17个氨基酸不完整的GmEID1蛋白。Gmeid1-4突变体比Gmeid1-3突变体开花期更晚。在LD和SD条件下，j突变体的开花期均与Gmeid1-3突变体相似，但比Gmeid1-4突变体早（图3 F、G），这表明GmEID1不仅能稳定J蛋白，也能稳定其他的J相似蛋白，包括GmELF3b-1和GmELF3b-2（图3 A-B）。此外，Gmeid1-3/j和Gmeid1-4/j的开花期分别与Gmeid1-3和Gmeid1-4的开花期相似（图3 F、G），这表明GmEID1和J在同一遗传途径中发挥作用。
图3 GmEID1与EC互作影响J蛋白的表达丰度来调控开花时间
5、光依赖的E3/E4与GmEID1的互作，干扰了GmEID1与J蛋白的互作（图4）。研究团队通过β-半乳糖苷酶的活性测定实验发现，在独立的红光或远红光条件下，光受体E3和E4能够与GmEID1互作（图4A）。Gmeid1/e3双突变体的开花期与Gmeid1突变体一样晚（图4B），这表明Gmeid1突变体可以完全抑制e3突变体的早花表型，GmEID1基因是E3基因的上游基因。接下来研究团队通过Co-IP的方法鉴定E3是否影响GmEID1和J的互作（图4C），结果显示GmEID1-YFP和J-Flag蛋白不与E3-Flag蛋白共表达。无论是光照还是黑暗的条件，在没有E3-Flag的情况下，J-Flag同样能被GmEID1-YFP共沉淀。然而，在E3-Flag存在的情况下，白光或者远红光条件下，J-Flag被GmEID1-YFP共沉淀的量要比黑暗条件下少得多（图4C）。以上结果表明光活化的E3/E4可以破坏GmEID1-J的互作，同时，E3/E4也许能促进J蛋白的降解。为了验证E3/E4能促进J蛋白的降解猜想，研究团队利用RICE系统比较了E3/E4存在或缺失情况下J-Flag的表达丰度。结果显示，在e3或e3e4突变体背景下J-Flag蛋白表达水平高于野生型（图4D）。研究团队通过J-Flag mRNA表达水平和J-Flag蛋白转录水平之间的相关性分析发现，J-Flag蛋白在e3e4或e3突变体中的表达积累比野生型更高效（图4F）。鉴于E3和E4介导光周期信号来调节开花时间，研究团队用一个稳定的过表达J-HA蛋白的转基因大豆品系来测试昼长是否会影响J蛋白的丰度。结果表明，J-HA蛋白的水平在SD条件高于LD条件（图4 E、G）。耐人寻味的是，J-HA蛋白表达在光照期间逐渐逐渐增加，这可能与E3/E4的mRNA和蛋白质在白天逐渐下降有关（图4 G）。综上所述，光活化的E3和E4作为一种竞争性的抑制子来干扰GmEID1-J的互作，从而促进E1基因的表达，抑制大豆的开花。
图4 光活化的E3/E4与GmEID1互作抑制GmEID1与J的互作来促进J蛋白的降解
6、GmEID1蛋白的失活能够改良大豆的适应性和产量表现（图5）。Gmeid1突变体除了开花期延迟，还表现出主茎粗壮、节间变短、节数和分枝增多的表型。研究团队在四个不同纬度地区（长春、北京、许昌和三亚）对该材料进行了产量的评估，结果显示Gmeid1的单株产量在各地区均显著增加，尤其是在TL1亲本品种的主要推广地（许昌），在正常种植密度下Gmeid1的单株产量较亲本增产17.2%。
图5在一个广泛的维度区域内，GmEID1基因的截断能够增加大豆的产量
综上所述，研究团队不仅解析了大豆GmEID1蛋白作为连接E3/E4和EC复合物的桥梁进而调控E1表达的分子机制，同时创制的Gmeid1突变体表现良好的环境适应性和增产潜力，为大豆育种提供了重要的基因资源。
Qin C, Li H, Zhang S, et al. GmEID1 modulates light signaling through the Evening Complex to control flowering time and yield in soybean[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2023, 120(15): e2212468120.
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