不结球白菜生长发育过程中表型变化作者：Lauri Nikkanen, Anita Santana Sánchez, Maria Ermakova, Matthias Rögner, Laurent Cournac, Yagut Allahverdiyeva
时间：2020年1月9日
杂志：BioRxiv生物学预印本
标题：Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803
研究背景：
光合生物具有不同的调控机制来应对环境条件快速变化，以保护光合机构免于损伤。波动光强可能会导致光合电子传递链（PETC），特别是光系统（PSI）的过度还原，从而给光系统带来损伤风险。为了解决这个问题，蓝细菌、藻类和植物（不包括被子植物）使用C型黄酮二铁蛋白（FDP）作为强大的光保护电子库，将多余的光合电子从PSI下游引导至O2。该过程称为类似Mehler的反应，但与Mehler反应相反，它不会产生有害的活性氧（ROS）。
β-蓝藻（集胞藻属PCC 6803，下文简称集胞藻）的基因组，编码四种FDP亚型，即Flv1-4，它们以Flv1和Flv3或Flv2和Flv4组成的杂合低聚物在O2光还原中起主要的作用。本文作者之前的研究表明，在空气CO2水平下，Flv1/3和Flv2/4杂聚物以协调和相互依赖的方式起作用：Flv1/3在照光开始时或在光强变强时刺激强烈的但短暂的O2光还原。Flv2/4杂聚物催化O2的稳态还原，速率缓慢且催化能力弱，但也可以消耗PSI下游的电子。在碱性条件下（pH为9）的高浓度CO2和空气CO2浓度中，编码Flv2，Flv4和Sll0218蛋白的flv4-flv2操纵子被下调。尽管如此，在高浓度的CO2中，Flv1/3的低水平会刺激强烈的稳态O2光还原，而在pH为9的空气CO2中，Flv1/3只负责强烈但短暂的O2光还原。体外实验表明重组Flv1，Flv3和Flv4的同型寡聚体可以通过NADH和/或NADPH还原O2，但FNR和还原态Fd是否是FDP的可能供体，尚未被证明。此外，与体外实验相反，单独过表达Flv1或Flv3的集胞藻突变体的研究清楚地表明， Flv3或Flv1的同型低聚物不参与体内O2的光还原。因此，体内FDPs的电子供体仍有待阐明。
在蓝藻中，光合作用和呼吸电子转移反应共存于类囊体膜上，并且相互错综复杂地联系在一起，需要进行严格的调控。NAD(P)H脱氢酶复合物1（NDH-1，光合复合物I）主要分布于类囊体膜中，参与多种生物能量反应，包括PSI周围的循环电子传递（CET），呼吸和通过碳浓缩机制(CCM)获得CO2。NDH-1复合物以几种形式存在，具有不同的生理作用：NDH-11型以NDHD1和NDHF1亚基为特征，并作为呼吸电子传递链的复合物I发挥功能；NDH-12则为NdhD2亚基，目前尚不清楚NDH-11和NDH-12是否具有不同的生理功能。NDH-13和NDH-14形式分别包括低Ci诱导的高亲和力CO2获取亚基NdhD3、NdhF3、CuPA和CUPS，或分别构成的低亲和力CO2获取亚基NdhD4、NdhF4和CuPB，在CO2到HCO3-(O)的转化中起作用。这一过程可能是由NDH-1质子泵在类囊体膜上产生碱性口袋实现的。所有四种NDH-1类型都催化CET从铁氧还蛋白(FD)到质体醌(PQ)，这与4H+/2e-泵入类囊体腔有关。然而，对于NDH-13,4，功能要弱于NDH-11,2。
在本研究中，我们旨在阐明FDPS和NDH-1介导的电子传递通路如何在可变光照和Ci-浓度变化下，在Calvin-Benson-Bassham循环(CBB)中协同维持PETC、呼吸、CCM和CO2固定之间的氧化还原平衡。为此，我们采用生物物理和生物化学方法对同时存在FDP和NDH-1途径缺陷的集胞藻突变株进行了研究。我们的结果为Flv1/3或NDH-11,2的存在提供了令人信服的证据，但不是NDH-13,4，需要说明的是NDH-13,4对于集胞藻在从高浓度CO2条件过渡到空气CO2和强光的联合胁迫条件下的生存是必不可少的。我们证明Flv1/3和NDH-11,2的动态协调和协同作用是集胞藻细胞光合结构光保护所必需的，并讨论了其中涉及的分子机制。
实验设计：
使用了耐葡萄糖的野生Synechocystis sp PCC 6803，单突变株Δflv1和Δflv3, M55突变株（ΔndhB）, 双突变体Δd1d2和Δd3d4和三突变体Δflv1d1d2, Δflv3d1d2, Δflv1d3d4和Δflv3d3d4。所有突变体均显示出完全分离。实验前的培养物以30ml分批培养在pH 7.5的BG-11培养基中，其他培养条件CO2为3％，温度30℃，中等光强（ML）50 µmolm-2s-1连续白光。突变的预培养物补充有适当的抗生素。在对数生长期，将细胞收获并重悬于新鲜的不含抗生素的BG-11中，OD750为0.1–0.2。然后将细胞转移到空气[CO2] / 30℃，并用50或220µmolm-2s-1的白光连续照射。
测量参数：
气体交换，荧光和差示吸收（Y(ND), Y(NA), Y(I)），近红外光谱吸收，77K荧光，NADPH，ECS, 蛋白质提取及免疫印迹, 波动光响应。
使用仪器：
DUAL-PAM-100，DUAL-KLAS-NIR, 9-AA/NADPH等
部分实验结果：
通过对单个FDP突变体（Δflv1和Δflv3）和双重NDH-1突变体（Δd1d2，其中NDH-11,2和Δd3d4缺乏，NDH-13,4），以及三重突变体（缺少Flv1或Flv3以及NDH-11,2或NDH-13,4之一）的研究表明，Flv1 / 3或NDH-11,2的存在对于生长条件从高CO2 /中等光照到低CO2 /高光照变化的生存是必不可少的。另外，在研究条件下，FDP和NDH-11,2之间存在功能冗余和串扰，并表明FDP和NDH-11,2的功能是动态协调的，以有效地氧化PSI，并在可变的CO2和波动光下进行光保护。
图1 WT和突变体在不同实验条件下的生长情况
所有的实验培养都是从预培养开始，调整到OD750=0.1。(A)细胞在3%[CO2]/中等光照(ML 50μmolm-2s-1)中预培养，调节OD750=0.1，在相同条件下生长。(B)细胞在3%[CO2]/中等光照下预培养，然后转移到空气[CO2]/中等光照中。(C)细胞在空气[CO2]/ML中预培养，然后转移到空气[CO2]/高光照中(HL 220μmolm-2s-1)。(D)细胞在3%[CO2]/ 中等光照下预培养，然后转移到空气[CO2]/ 高光照中。A-D中显示的值是三个独立的生物重复±SE的平均值。(E)WT细胞和突变细胞在含有BG-11的琼脂平板上生长的结果。收集生长在3%[CO2]/ML下的细胞，以10倍梯度稀释后点到BG-11琼脂平板上，从OD750=1开始，分别在空气[CO2]/ML和空气[CO2]/HL下孵育7d。更多结果参考补充数据S1.
图2 WT和突变体的O2和CO2交换率
细胞在空气[CO2]/ML中培养4天后收获细胞，用新鲜的BG-11调节Chla浓度至10μg·ml-1。暗适应15min，用500μmolm-2s-1的白光照射5min，用膜进样质谱计监测气体交换情况。在测量之前，样品添加了与16O2浓度相同的18O2，以区分O2的摄取和放氧，并添加了1.5 mM的NaHCO3。每组的虚线表示CO2固定的补偿点(摄取速率等于呼吸速率)。实验设置了三个独立的生物重复，给出了具有代表性的测量结果。
图3 WT和突变体在不同光强下的光合参数
(A) PSI的受体侧限，Y(NA)，(B)PSI的供体侧限，Y(ND)，以及(C)PSI的有效产率，Y(I)根据在875-830 nm处的差示吸收变化计算。叶绿素a荧光变化与PSI氧化还原变化同步测量，用于计算(D)PSII的有效产率。细胞在空气中培养4d后收获细胞，用新鲜BG-11调节Chla浓度至10μg ml-1。将细胞暗适应10min，然后用红色光化光强度在25和530μmolm-2s-1之间交替照射1min。每15秒提供饱和脉冲(Width: 500ms, Int.: 5000μmolm-2s-1)。所显示的值是3-4个独立生物重复±SE的平均值。
图4 WT和突变体在波动光下的NADPH和Chl a荧光
WT(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2细胞(D)在空气[CO2]/ML中培养4d后，收集细胞，用新鲜BG-11调节Chla浓度至5μg ml-1。暗适应10min后，用25/530μmolm-2s-1的交替红光照射1min。用Dual-PAM 100双通道叶绿素荧光仪及其9-AA/NADPH附件模块监测NADPH氧化还原变化，方法是测量365 nm激发引起的420至580 nm之间的荧光变化。同时记录叶绿素a荧光。(E)暗适应细胞在530μmolm-2s-1照射过程中，NADPH氧化还原发生变化。其他实验细节如A-D所示。(F)显示(E)中照明的前2秒的放大结果。这些值分别根据在照明开始和停止时的最小和最大荧光变化来归一化。用三个独立的生物重复进行了实验，其中显示了具有代表性的测量结果。RU。=相对单位。
图5 黑暗到HL转变过程中PC、P700和FD的氧化还原变化，以及pmf的建立
将wt(A)、Δflv3(B)、Δd1d2(C)和Δflv3 d1d2(D)暗适应10min，然后用DUAL-KLAS-NIR四通道近红外光谱仪测量在503μmolm-2s-1红光照射30s期间，在780-800 nm，820-870 nm，840-965 nm和870-965 nm处吸光度的差异变化。使用为本研究确定的差分模型曲线图(DMPS)将PC、P700和Fd信号从吸光度差异变化中去卷积(图S3)。A-D中的上图显示了下图前1.5秒照光过程的放大结果。实验设置了三个独立的生物重复，其中显示了具有代表性的测量结果。另请参阅补充图S3。(E)从暗到500μmolm-2s-1的绿色光化光的过渡过程中pmf的积累。用JTS-10型光谱仪测量了500-480 nm(ECS)的吸光度差，根据ECS信号的暗间隔弛豫动力学(DIRK)测定了光诱导的pmf。给出了3-4个独立实验的平均值±SEM。小插图显示照明1s后的pmf值，以获得更清晰的视图。(F) 如(E)，在光照1s和30s后的类囊体膜质子导度(gH+)。gH+是通过ECS信号在第一次光照后衰减动力学时间常数的倒数来计算的。(G)类囊体质子通量(vH+)，以pmf×gH+计算。(H)500-480 nm吸光度差的代表性结果，用于测量E中的结果以及在光照30秒后的500 ms暗间隔期间ECS衰减动力学的值(下图)。拟合曲线显示为绿色。在空气[CO2]/ML中生长4d后收获细胞，用新鲜BG-11调节Chla浓度至10 μg ml-1(A-D)，7.5μg ml-1(E-J)。
图6 WT和突变体光合作用和CCM相关蛋白的免疫印迹检测和77K荧光发射光谱
预培养在3%[CO2]/ML下培养3天，然后收获，再悬浮在OD750=0.15新鲜的BG-11中，(A)在空气[CO2]/ML中培养24小时，(B)在空气[CO2]/ML中培养4天，收获后再悬浮在OD750=0.15的BG-11中，然后在空气[CO2]/ML中培养24小时。(C)在空气[CO2]/HL中孵育24小时。用SDS-PAGE分离总蛋白提取物，并用特异性抗体进行检测。所示的免疫印迹代表2-3个独立的生物学重复。(D)完整的WT和ΔFlv3d1d2细胞在空气[CO2]/ML中生长4天的77K荧光发射光谱。(E)在3%[CO2]/ML中预培养生长后收获，再悬浮在OD750=0.15的新鲜BG-11中，在空气[CO2]/HL中孵育24小时。将细胞(D和E)收获，调节到Chla为7.5μg ml-1，在77K用440 nm光激发。将光谱归一化为685 nm处的PSII荧光峰。
图7 协调FDPs和NDH-1的活性以防止PSI过度还原的模型示意图
(A)在Fd库大量还原而PQ库没有还原的条件下，NDH-1L将电子从Fd转移到PQ池，同时通过类囊体局部RTOs还原O2。NDH-1L将2H+/e-泵入管腔，而FDP和RTO在类囊体液面将O2还原为H2O时消耗H+。这增加了跨类囊体pmf，而pmf反过来推动ATP合成，抑制Cytb6f处的PQH2氧化，从而防止进一步向PSI提供过多的电子。NDH1-MS的碳酸酐酶活性将HCO3-转化为CO2，消耗胞质中的H+，可能还耦合了H+到管腔的转运，进一步增加了pmf。CO2利用率和ATP/NADPH比值的增加提高了CBB在PETC受体侧的电子吸收能力。(B)如果PQ库被高度还原，Fd库被氧化，并且pmf很高，则假设NDH-1L可以起相反的作用，通过从管腔释放2H+/e-来将电子从PQH2转移到Fd+。由Flv1/3催化的强Mehler式反应在此时就非常有必要，以维持足够的氧化态Fd库，Flv1/3可能直接接受来自Fd-的电子。(A)中所述的大部分成分在(B)中被省略，以提高清晰度，而不是暗示它们不存在。PQ/PQH2和Fd的颜色填充范围表示还原的水平。
由于相关研究内容非常专业，难免有些理解不准确或者编辑整理的疏漏，请以英文原文为准。
Nikkanen L E, Sanchez A I S, Ermakova M, et al. Functional redundancy and crosstalk between flavodiiron proteins and NDH-1 in Synechocystis sp. PCC 6803. bioRxiv, 2020: 2019.12. 23.886929.